Echolocatie en horen: prestine

Niet alleen vleermuizen gebruiken echolocatie om hun weg te vinden of hun prooi te vangen. Andere zoogdieren gebruiken het ook: de tandwalvissen en sommige spitsmuizen. Bij de dolfijnen staat het bekend als sonar. Misschien kunnen alle zoogdieren in principe echolocatie gebruiken. Tenminste, ook blinde mensen kunnen zich op echolocatie trainen, en waarom zouden ze hierin uitzonderlijk zijn? Echolocatie is gebaseerd op stereo horen, op het vinden van de richting waaruit een geluid komt door het hebben van twee oren. Een grote oorschelp is heel nuttig daarbij.


Gewone grootoorvleermuis, en twee keer een hoefijzerneus.
http://diertjevandedag.classy.be/zoogdieren/vleermuizen/startpagina_vleermuizen.htm

Bij de vleermuizen gebruiken de microbats echolocatie door roepen. Vleermuizen, microbats dus, en tandwalvissen als de potvis en de dolfijnen gebruiken echolocatie voor het vangen van een prooi, en voor het vinden van hun weg. Spitsmuizen gebruiken echolocatie alleen voor het inschatten van de omgeving. Spitsmuizen en microbats zijn nachtbeesten. Onder water is de gezichtshorizon voor jagende walvissen beperkt. Horen neemt de rol over van zien.

De spitsmuizen met echolocatie geven misschien een aanwijzing over hoe vleermuizen aan hun echolocatie komen. De vraag is natuurlijk welk van de twee scenario’s meer onderbouwing kan krijgen: eerst vliegen en dan echolocatie, of eerst echolocatie en dan vliegen. Het is duidelijk dat echolocatie bij de vleermuizen in de loop van de tijd uitgebouwd en versterkt is (zie HIER). De twee oudste vleermuizen waarvan genoeg schedel bekend is, Onychonycteris finneyi en Icaronycteris index, hebben geen vergroot binnenoor. Bij Icaronycteris index zijn er wel verdere aanwijzingen in het schedelskelet bij het oor die op echolocatie wijzen, maar bij Onychonycteris finneyi niet of nauwelijks. Alleen de plaats van het botje styohyale, verder niet. Voor details over Onychonycteris finneyi en Icaronycteris index, zie HIER.

Daarom zou het heel interessant zijn hoe het oor van de spitsmuizen die aan echolocatie doen er uit ziet. Is er bij de spitsmuizen iets in de bouw van het oor waaraan je kunt zien dat ze aan echolocatie doen? Als zoiets er is, zou je eerder denken dat Onychonycteris finneyi geen echolocatie had. Maar als er niets in een spitsmuisoor is waaruit echolocatie valt op te maken – terwijl je weet dat ze aan echolocatie doen – blijft de mogelijkheid voor echolocatie bij Onychonycteris finneyi open. En daarmee zou het scenario met echolocatie vóór vliegen voor de vleermuizen blijven bestaan.
Er is jammer genoeg niets bekend over de oren van de spitsmuissoorten met echolocatie. Ik heb het nog bij de schrijver van het artikel over echolocatie bij spitsmuizen, Siemers, nagevraagd.

Zoogdieren kunnen hogere tonen horen dan vogels of hagedissen, en vleermuizen kunnen hogere tonen horen dan de meeste zoogdieren. Mensen horen geluiden van ongeveer 20 Hertz tot 20000 Hertz, 20 kHz; de standaard pianotoon A voor de stemming is 440 Hz, de hoogste toon van een piano is C8, 4186.01 Hz, 4.2 kHz. Vleermuizen maken en horen geluid van 14 kHz tot boven de 100 kHz. Dolfijnen kunnen een sonar boven 100 kHz gebruiken.



Zoogdieren kunnen hogere geluiden horen dan vogels en hagedissen, hier gedemonstreerd voor de cavia, de kip en de gecko. Manley 2000 figuur 2

Hoe slagen zoogdieren erin hogere tonen te horen dan vogels of hagedissen? Ze hebben een heel ander oor. Bij de gewervelde dieren is het oog voor alle groepen gelijk in bouw, maar het oor verschilt stevig. Tussen de amfibieën en de echte landvertebraten, en binnen de landvertebraten tussen de hagedissen + slangen, de vogels en de zoogdieren. Het zoogdieroor schijnt het ingewikkeldst te zijn, en het meeste te kunnen. Dat is te danken aan de bouw van het oor, en aan het eiwit prestine.

Een beetje over de bouw van het binnenoor
Het zoogdier binnenoor bezit in het slakkenhuis Binnenste Haar Cellen (Inner Hair Cells, IHC) en Buitenste Haar Cellen (Outer Hair Cells, OHC). De Buitenste Haar Cellen versterken geluid, en de Binnenste Haar Cellen nemen het versterkte geluid waar en sturen de waarneming door naar de hersenen. Hoe dat versterken van geluid precies werkt komt later (in een volgende blogpost) nog. Hier is alleen van belang dat de Buitenste Haar Cellen geluid waarnemen en versterken. De Buitenste Haar Cellen reageren elk op een eigen geluidsfrequentie, en versterken die door samen te trekken. Voor dat samentrekken is een motoreiwit nodig, en dat motoreiwit is prestine. Dan ligt het voor de hand dat prestine bij vleermuizen ook in Buitenste Haar Cellen die heel hoge geluidsfrequenties oppikken moet kunnen werken.

Het eiwit prestine
Het eiwit prestine is omstreeks 740 aminozuren lang en slingert zich in vijf of zes lussen door de celmembraan. Vijf of zes lussen: de onderzoekers weten dit niet zeker. Het eiwit ziet er misschien uit als op het volgende plaatje. Het plaatje geeft de versie met zes lussen; andere artikelen gebruiken een versie met vijf lussen.


Elgoyhen en Franchini 2011 figuur 1

In de figuur staat de celmembraan aangegeven door een schetsje van de vetmoleculen waaruit de celmembraan is opgebouwd: dat zijn de zwarte koppen met de kronkelige staarten. Prestine heeft een aantal spiralen die binnen de celmembraan liggen: de transmembraan domeinen (geel). Verder zijn er lussen aan de buitenkant van de cel (boven), en lussen en uiteinden binnen de cel (onder in de figuur). Het stikstof- (N, amino) -uiteinde van het eiwit is links en het C (koolstof, zure) uiteinde van het eiwit is rechts getekend. Bij het rechteruiteinde (binnen de cel) zijn een positief geladen deel, een negatief geladen deel en een STAS blok aanwezig. Een STAS blok is iets dat ook in andere eiwitten voorkomt.
Zo ziet prestine eruit. Waar we nu in geïnteresseerd zijn is in verschillen in prestine tussen verschillende soorten.

Het eiwit prestine vergeleken tussen vleermuissoorten
Li Gang en vijf andere onderzoekers keken in 2008 naar prestine in een aantal vleermuizen, en een paar andere zoogdieren als achtergrond. De vleermuizen waren twee soorten uit de familie gladneuzen, de Vespertilionidae, van de Yangochiroptera, en diverseYinpterochiroptera soorten. De vleermuizen uit de Yinpterochiroptera waren twee megabats en een aantal Yinochiroptera soorten waarvan de meeste aan roepende echolocatie doen (en ook ‘microbats’ zijn). Die Yinochiroptera soorten met echolocatie zijn soorten van de families hoefijzerneuzen Rhinolophidae en de Oude Wereld bladneuzen Hipposideridae.



Hipposideros ridleyi http://en.wikipedia.org/wiki/Hipposideros_ridleyi


Rhinolophus ferrumequinum http://nl.wikipedia.org/wiki/Grote_hoefijzerneus


Deze hoefijzerneuzen en Oude Wereld bladneuzen hebben een speciale manier van echolocatie, met relatief lange roepen die gedomineerd worden door één frequentie. Dat heet Constant Frequency, en die twee groepen vleermuizen heten CF vleermuizen.

De moleculaire indeling voor de soorten is als in de volgende figuur, op grond van ander onderzoek:


Moleculaire indeling voor de soorten. Zwart: geen vleermuizen. Rood: gladneuzen, familie Vespertilionidae uit de Yangochiroptera. Blauw, groen en oranje zijn allemaal Yinpterochiriptera. Blauw: megabats, Pteropodidae. Oranje: geslacht Megaderma (valse-vampiervleermuis). Groen: Hoefijzerneuzen en Oude Wereld bladneuzen, CF echolocatie Yinochiroptera. Li et al PNAS 2008 fig 3

De verrassing kwam toen Li Gang’s groep deze beesten sorteerden op het DNA voor het eiwit prestine. Dat geeft de volgende uitslag:


Moleculaire indeling voor het gen voor prestine. Zwart: geen vleermuizen. Rood: gladneuzen, familie Vespertilionidae uit de Yangochiroptera. Blauw, groen en oranje zijn allemaal Yinpterochiriptera. Blauw: megabats, Pteropodidae. Oranje: geslacht Megaderma. Groen: Hoefijzerneuzen en bladneuzen, CF echolocatie, Yinochiroptera. Getallen geven statistische onderbouwing op 4 manieren; 100 is steeds de hoogst mogelijke score. Rechthoekjes geven een grafiekje voor de roep, x-as frequentie y-as sterkte. Li et al PNAS 2008 fig 1.

De twee Yangochiroptera, dat zijn de in rood aangegeven soorten, en de Yinochiroptera met echolocatie, de groen aangegeven soorten, lijken nu het meest op elkaar. En dat is statistisch goed onderbouwd: zie de getallen in de figuur. De moleculaire indeling voor het gen prestine wijkt af van de moleculaire indeling voor de soorten.

Dat vraagt wat nadenken. Wat kan er aan de hand zijn? De onderzoekers keken in meer detail kijken.

De onderzoekers schiftten hun gegevens op twee manieren.
Ten eerste zijn er veranderingen in het DNA van prestine die niet tot verandering in aminozuur leiden, en zijn er veranderingen in het DNA van prestine die wel tot verandering in aminozuur leiden. Ten tweede zijn er stukken DNA die horen bij de eiwitspiralen die in de celmembraan zitten en zijn er stukken DNA die coderen voor de lussen buiten de cel of de lussen binnen de cel of de losse uiteinden binnen de cel.

Bij de eerste schifting gebruikten de onderzoekers de 414 basenpaar die horen bij aminozuren die verschillen tussen de soorten voor een moleculaire indeling. Deze moleculaire indeling geeft heel duidelijk de moleculaire indeling van het gen prestine, dus figuur 1 uit PNAS (die hier als tweede weergegeven staat). Iets meer dan 1800 basenpaar codeert voor aminozuren die niet verschillen tussen de soorten. Werken met dit DNA geeft de indeling volgens de soorten, figuur 3 uit PNAS (die hier als eerste weergegeven staat). De afwijking in de moleculaire indeling is dus alleen aanwezig voor de aminozuren waar verschil in zit, en komt niet terug in verschillen in het overige DNA.

Bij de tweede schifting gebruikten de onderzoekers de 681 DNA-basen voor de eiwitspiralen in de celmembraan, het transmembraan domein, en de 1539 DNA-basen voor de lussen en uiteinden apart voor twee moleculaire indelingen. De moleculaire indeling voor het transmembraan deel van prestine geeft de indeling volgens de soorten. De lussen en de uiteinden gebruiken geeft de indeling van prestine.

Dit betekent dat er bij de bladneuzen, hoefijzerneuzen en gladneuzen relatief veel overeenkomstige aminozuren zitten in de lussen en de uiteinden. Dat doet denken aan een verband tussen het horen van hoge geluiden uit echolocatie en welke aminozuren prestine precies heeft. Misschien is de aanwezigheid van bepaalde aminozuren in beesten met echolocatie het gevolg van selectie voor overeenkomst in het eiwit prestine, onafhankelijk van de verwantschap van de soorten.

Tot nu toe is dit heel leuk, maar dan komt de vraag welke aminozuren tot hoge tonen horen zouden kunnen leiden. Li Gang en medewerkers vertellen niet over welke aminozuren het eigenlijk zou gaan.
In de Supplementary Info staat welke verschillen er gevonden zijn in prestine, dus ik ging er zelf naar kijken. Dan blijkt de hele studie veel zwakker dan iemand uit de hoofdtekst op zou maken. De overmaat CF-vleermuissoorten in de studie kan de hele zaak vertrokken hebben.

Er zijn zeven soorten CF-vleermuizen in de studie. Er zijn op 21 plaatsen in het eiwit prestime aminozuurveranderingen die al deze soorten gezamenlijk hebben, en verder niet in een andere soort voorkomen. Er zijn twee veranderingen die zowel de CF-vleermuizen als Megaderma hebben, en drie veranderingen die zowel de CF-vleermuizen als Myotis hebben, en één aminozuurverandering die zowel de CF-vleermuizen als Myotis en Miniopterus hebben. En er is één aminozuurverandering die alle vleermuizen met echolocatie gezamenlijk hebben en verder niet voorkomt. Dat is threonine in plaats van arginine op plaats 7.

Er zijn nu meer prestines bekend, met een iets betere spreiding van de soorten over de groepen. Prestine is nu bekend voor vijf Yangochiroptera, twee Megaderma soorten en vier megabats naast de zeven CF soorten. In de Supplementary Information van de artikelen staat aangegeven onder welk nummer het prestine van elke soort in de internet databank GenBank staat. Die heb ik opgezocht, via GenBank en Entrez. Daarna heb ik ze gesorteerd via ClustalW.


Resultaat ClustalW: alle bekende vleermuizen en wat knaagdieren, paard, koe als referentie. De vleermuizen met echolocatie vormen een groep, de megabats komen niet naast de hoefijzerneuzen en Oude Wereld bladneuzen. Het schaalstreepje onderaan geeft gemiddeld aantal veranderingen over het hele eiwit.

Het beeld blijft grotendeels hetzelfde: threonine in plaats van arginine op plaats 7 voor alle vleermuizen met echolocatie, en her en der overeenkomst tussen CF-vleermuizen en andere vleermuizen met echolocatie. Alleen de overeenkomst op aminozuurplaats 26 tussen de Yangochiroptera en de CF-vleermuizen is nu duidelijk: leucine in plaats van phenylalanine.

Dus: ja, er kan sprake zijn van selectie, op twee manieren. Ten eerste hebben de CF-vleermuizen heel veel veranderingen ten opzichte van de overige vleermuizen. Die veranderingen gaan zo snel dat het statistisch aan selectie wordt toegeschreven. Ten tweede is er enige overeenkomst in specifieke veranderingen tussen CF vleermuizen en andere vleermuizen met echolocatie.

Het eiwit prestine vergeleken tussen vleermuizen en tandwalvissen
De hypothese dat sommige aminozuurvolgorden van prestine tot het kunnen horen van hogere frequenties leiden en daarmee gunstig zijn voor echolocatie, kan getoetst worden door ook naar de dolfijnen te kijken.

Er zijn drie artikelen over prestine in vleermuizen en walvissen, van Li Ying in januari 2010 (artikel 1), van Liu Yang in januari 2010 (artikel 2) en van Liu Yang in oktober 2010 (artikel 3). In die volgorde komen er steeds meer walvisachtigen bij.

Artikel 1 had alleen de tuimelaar Tursiops truncatus. Li Ying vond net als Li Gang in 2008 dat de microbats, die met echolocatie, in hun prestine overeenkomen. Bovendien liet Li Ying zien dat de tuimelaar tussen de vleermuizen terecht komt voor wat betreft zijn prestine. Om precies te zijn, de tuimelaar komt bij de hoefijzerneuzen en Oude Wereld bladneuzen, de Yinochiroptera beesten met Constant Frequency echolocatie, te staan.


De tuimelaar (bottlenose dolphin, in bruin) tussen de vleermuizen. Zwart: beesten voor achtergrond. Blauw: megabats (geen echolocatie). Paars: Yangochiroptera. Oranje: Megaderma (valse-vampiervleermuis). Groen: Hoefijzerneuzen en bladneuzen, CF echolocatie, Yinochiroptera. Li et al 2010 figuur 1A.

De tweede studie, van Liu Yang en zijn groep in januari 2010 had gegevens voor vijf tandwalvissen en voor twee baleinwalvissen. Dat betrof voor wat betreft de tandwalvissen de potvis (Physeter macrocephalus) en de dolfijnen de tuimelaar, de gewone dolfijn (Delphinus delphis), de gramper of grijze dolfijn (Grampus griseus), en de bruinvis (Phocoena phocoena). De baleinwalvissen in deze studie waren de gewone vinvis (Balaenoptera physalus) en de bultrug (Megaptera novaeangliae).


Zwart: beesten voor achtergrond. Groen: baleinwalvissen. Lichtblauw: tandwalvissen; fel lichtblauw: dolfijnen (indeling 1); vaag lichtblauw: dolfijnen en potvis (indeling 2). Oranje: megabats. Marineblauw: microbats. Microbats bovenaan: Hoefijzerneuzen en bladneuzen, CF echolocatie Liu et al 2010 januari figuur 1A.

De eerste moleculaire indeling (doorgetrokken lijn in de figuur) was zonder de potvis, met alleen de dolfijnen voor de tandwalvissen. Dan komen de dolfijnen weer als zustergroep van de hoefijzerneuzen en bladneuzen, de beesten met CF echolocatie, te staan. Dat is de positie van de dolfijnen in helder lichtblauw. De dolfijnen kwamen niet als zustergroep naast de twee baleinwalvissen te staan. Er is iets aan de hand!
Toen de potvis, een grote tandwalvis die veel lagere geluidsfrequenties voor echolocatie gebruikt, in de moleculaire indeling opgenomen werd veranderden de tandwalvissen van plaats. De tandwalvissen in hun geheel, dolfijnen en potvis, kwamen netjes op hun plaats naast de baleinwalvissen terecht (stippellijn in de figuur). Dat betekent dat het de tandwalvissen met echolocatie met hoog geluid zijn die in hun prestine lijken op de vleermuizen, en wel de vleermuizen met hoog strak geluid.

De derde studie, weer van Liu Yang en zijn medewerkers maar nu gepubliceerd in oktober 2010, bekeek nog vijf walvissen extra. De dwergpotvis (Kogia breviceps); drie spitssnuitdolfijnen met wat sonar op wat lagere frequentie: de dolfijn van Cuvier (Ziphius cavirostris), de spitssnuitdolfijn van de Blainville (Mesoplodon densirostris); en de noordelijke butskop (Hyperoodon ampullatus); en de dwergvinvis (Balaenoptera acutorostrata) die bij de baleinwalvissen hoort.

Deze derde studie kijkt in meer detail naar de aminozuren (anders was het ook niet de moeite waard geweest). Volgens Liu Yang zijn er in totaal 26 aminozuren die prestine bij vleermuizen op een of andere manier op die van de tandwalvissen laten lijken, en 29 aminozuren in prestine die sommige van de vleermuizen met echolocatie uit de Yinpterochiroptera met de vleermuizen van de Yangochiroptera gemeen hebben. Van die 26 aminozuren zijn er 10 die ook bij de groep van 29 horen.
Leuk, alleen geven Liu en zijn medewerkers geen tabel over welke aminozuren het gaat. Ze geven wel een moleculaire indeling van alle walvissen met daarbij in de figuur aangegeven welke aminozuren vervangen zijn en of dat op een of andere manier overeenkomt met vervangingen in de vleermuizen. Dat geeft een figuur met veel puzzelwerk voor de lezer, maar inzichtelijk is het niet.

Aan de andere kant, iedereen kan het nagaan. Dus zelf weer aan het werk. In de Supplementary Information van de artikelen staat aangegeven onder welk nummer het prestine van elke soort in de internet databank GenBank staat. Die heb ik opgezocht, weer via GenBank en Entrez. Daarna heb ik ze allemaal gesorteerd via ClustalW.


Dit is de weergave van de Guide Tree van de ClustalW sortering. De indeling van de prestines van de beesten met echolocatie is in de rechterfiguur in blauw aangegeven.

De tandwalvissen, dus de dolfijnen + spitssnuitdolfijnen + potvissen, komen in hun prestine het meest overeen met de CF vleermuizen, dus de hoefijzerneuzen en de Oude Wereld bladneuzen. De tandwalvissen en de CF vleermuizen samen komen het meest overeen met andere microbats, de Yangochiroptera en het geslacht Megaderma. Dat zijn allemaal beesten met echolocatie. De beesten met echolocatie komen daarna overeen met de megabats. De baleinwalvissen komen bij de koe uit, zoals op grond van de algemene moleculaire indeling voor alle walvissen geldt.

De vraag is dan: welke aminozuren komen overeen tussen vleermuizen en walvissen, of tussen sommige vleermuizen en sommige walvissen?

Een bekende is N7T: threonine vervangt asparagine op plaats 7 in de tandwalvissen en alle microbats. Dat is een bevestiging van het belang van deze aminozuur vervanging.


Foto’s van ClustalW output: links staat de soortenlijst. Langs de bovenrand moet de positie van het aminozuur in het eiwit staan, maar dat staat altijd niet op de foto van het computerscherm. In een kolom staat aangegeven welk aminozuur op een bepaalde plaats gevonden wordt.
Links: Plaats 7: de meeste overeenkomst: vleermuizen met echolocatie en tandwalvissen
Midden Plaats 392: tandwalvissen en CF-vleermuizen
Rechts: Plaats 601: dolfijnen en CF-vleermuizen.

Verder is overeenkomst tussen de tandwalvissen en CF-vleermuizen op plaats 384, en tussen tandwalvissen, CF-vleermuizen en twee gladneuzen plaats 392 en plaats 566. Bij de dolfijnen is er nog meer overeenkomst met de vleermuizen. Dolfijnen en alle CF-vleermuizen op plaatsen 568 en 601, dolfijnen en hoefijzerneuzen op plaats 700, dolfijnen en bladneuzen op plaats 167, en dolfijnen en gladneuzen op plaats 305.


De plaats van de belangrijkste overeenkomsten tussen vleermuizen en tandwalvissen in het eiwit prestine. De figuur is afkomstig uit de studie met alleen de tuimelaar van Li Ying et al 2010 fgiuur 1C. De gekleurde pijlen zijn toegevoegd. Li Ying beschouwde een groter aantal aminozuurveranderingen als mogelijk belangrijk, maar dat lijkt niet uit te komen.

Al met al:
De verandering van arginine naar threonine op plaats 7 in het eiwit prestine komt bij alle bekeken beesten met echolocatie voor en bij geen enkel beest zonder echolocatie. Dat is daarmee de eerste kandidaat voor functieverandering van prestine en selectie op die functie.
Verder is er meer overeenkomst in aminozuurverandering tussen dolfijnen en CF-vleermuizen dan tussen CF-vleermuizen en andere vleermuizen met echolocatie! Die aminozuurveranderingen die CF-vleermuizen en dolfijnen gemeenschappelijk hebben zijn daarmee ook kandidaten voor functieverandering van prestine en selectie.
Om zeker te zijn van selectie moeten we de functie van prestine precies weten, en weten wat voor invloed elk aminozuur heeft.

Dus de vraag is: hoe werkt prestine?

**********************
Elgoyhen A.B. & L.F. Franchini, 2011. Prestin and the cholinergic receptor of hair cells: Positively-selected proteins in mammals. Hearing Research 273 (2011) 100-108
Li G., J. Wang, S.J. Rossiter, G. Jones, J.A. Cotton & S. Zhang, 2008. The hearing gene Prestin reunites echolocating bats. PNAS 105:13959-13964.
Li Y., Z. Liu, P. Shi & J. Zhang, 2010. The hearing gene Prestin unites echolocating bats and whales. Current Biology 20: R53.
Liu Y., J.A. Cotton, B. Shen, X. Han, S.J. Rossiter & S. Zhang, 2010. Convergent sequence evolution between echolocating bats and dolphins. Current Biology 20: R55.
Liu Y., S.J. Rossiter, X. Han, J.A. Cotton & S. Zhang, 2010. Cetaceans on a molecular fast track to ultrasonic hearing. Current Biology 20: 1834–1839.
Manley, G.A., 2000. Cochlear mechanisms from a phylogenetic viewpoint. PNAS 97: 11736–11743.
Siemers, B.M., G. Schauermann, H. Turni & S. von Merten, 2009. Why do shrews twitter? Communication or simple echo-based orientation. Biology Letters 5:593-596.

http://nl.wikipedia.org/wiki/Tandwalvissen
http://en.wikipedia.org/wiki/Odontoceti
http://en.wikipedia.org/wiki/Human_echolocation
http://en.wikipedia.org/wiki/Animal_echolocation
http://nl.wikipedia.org/wiki/Gehoor

Rhinolophidae http://nl.wikipedia.org/wiki/Hoefijzerneuzen
Hipposideridae http://nl.wikipedia.org/wiki/Bladneusvleermuizen_van_de_Oude_Wereld

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenbankSearch.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/